以提取14个样品的RNA为例:
前期准备工作:
1.分别清洗14个研钵、研磨棒、金属勺子,清洗完成后用卫生纸擦干,随后用锡纸将研钵、研磨棒、勺子包住并,并灭菌备用;
2.装一盒蓝枪头(1000μ),一盒黄枪头(200μ),一盒白枪头(10μ),并用报纸包裹住,灭菌备用;
3.带上锡纸,装液氮,在田间取样后立刻用锡纸包裹住样品,并置于液氮中速冻备用;
RNA的提取:
1.将样品置于研钵中,倒入液氮(可用纸杯分装液氮),用研磨棒将样品研磨成粉末状,取研磨后的粉末加入600μ裂解液SG和10μProteinase K,立即涡旋剧烈震荡混匀,混匀后室温放置5min;
2.12000 rpm离心2min,取约500μ上清进行以下操作
注意:枪头尽量不要触碰到沉淀底部,以免吸到杂质
3.将得到的上清加入基因组DNA去除柱中,12000rpm离心30s,保留滤液;
4.向上述滤液中缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(约250μ),混匀,得到的溶液和沉淀一起转入RNase—Free吸附柱CR4中(吸附柱放在收集管中),12000 rpm离心30S,弃掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中;
5.不进行DNase Ⅰ消化,直接向RNase—Free吸附柱CR4中加入700μ去蛋白液RW3,12000 rpm 离心30S,弃废液,将吸附柱放回收集管中;
6.向RNase—Free吸附柱CR4中加入500μ漂洗液RW,漂洗液RW在使用前需要加入无水乙醇,室温静置2min,12000 rpm 离心30-60S,弃废液,将吸附柱放回收集管中;
7.重复步骤6;
8.12000 rpm 离心2min,倒掉废液。将RNase—Free吸附柱CR4置于室温放置2min,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液(注意:此步骤目的是将RNase—Free吸附柱CR4中残余的漂洗液去除,漂洗液的残留,可能会影响后续的RT等实验。)
9.将RNase—Free吸附柱CR4转入一个新的RNase—Free离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μ RNase—Free H2O,室温放置2min,12000 rpm 离心2min,得到RNA溶液
注意:洗脱缓冲液体积不应该少于30μ,体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存