使用前请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签
实验前的准备:用液体CM培养基过夜培养的细菌,2 ml离心管,1.5 ml离心管,蓝枪头一盒,黄枪头一盒,步骤10后必须打开金属浴和水浴锅,
1.取2.0 ml离心管,加入细菌培养液1 ml(细菌用液体CM培养基培养),离心1min,尽量吸净上清;
2. 向菌体沉淀中加入200 μl缓冲液GA,振荡至菌体彻底悬浮。
注意:对于较难破壁的革兰氏阳性菌,可略过第2步,加入溶菌酶溶液进行破壁处理,具体方法为:加入110 μl缓冲液(20 mM Tris,pH 8.0;2 mM Na2·EDTA; 1.2%Triten),和70 μl溶菌酶溶液(50 mg/ml,客户自备,目录号:RT401),37℃处理30 min以上。如果需要去除RNA,可加入4 μl RNase A(100mg/ml)溶液(客户自备,目录号:RT405-12),振荡15 sec,室温放置5 min。
3. 向管中加入20 μl Proteinase K溶液,混匀。
4. 加入220 μl缓冲液GB,振荡15 sec,70℃放置10 min,溶液应变清亮,简短离心以去除官盖内壁的水珠。
注意:加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀,一般70℃放置时会消失,不会影响后续实验。如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA少量和提取出的DNA不纯。
5. 加220 μl无水乙醇,充分振荡15 sec,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内的水珠。
6. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放在收集管中),12, 000 rpm离心1 min,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
7. 向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD(使用前请检查是否已加入无水乙醇),12, 000 rpm离心1 min,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
8. 向吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW(使用前请检查是否已加入无水乙醇),12, 000 rpm离心1 min,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
9. 重复操作步骤8
10. 将吸附柱CB3放回收集管中,12, 000 rpm离心2 min,倒掉废液,将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
11. 将缓冲液TE置于60 ℃水浴预热,以提高膜的通透性;将吸附柱CB3转入一个干净的1.5 ml离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μl洗脱缓冲液TE,室温放置2-5 min,12, 000 rpm离心2 min,将溶液收集到离心管中。
12. 将收集到离心管中的溶液置于60℃ 金属浴2 min,吸取金属浴后的溶液再次滴加到CB3吸附柱的吸附膜上,室温放置2 min,12, 000 rpm离心2 min。
13. 测浓度,并将DNA稀释到合适的浓度后置于-20℃保存。