找到两个有明显差异性状的高代自交系，比如抗病和感病，经人工鉴定后，证实抗性无误，则杂交得F₁，F₁自交以及和感病亲本回交，得到F₂和BC₁。接种BC₁或者F₂，得到抗感分离材料，在抗感分离材料中取极端抗病/感病样品构建极端混池，进行BSA-seq，接种双亲后，取抗病亲本和感病亲本做转录组分析，BSA分析结合转录组分析，将定位到某一区间，通过对区间内基因功能进行blast解析，推测和目的性状有关的基因，随即进行Crispr敲除验证和过表达功能验证，验证其基因功能

其中的难点有以下几点：

• 1.确定一个稳定高效的接种环境。
• 2.双亲稳定抗病/感病。
• 3.BSA结果分析时，通过对BSA区间设计引物，不断缩小区间，如果抗病的显性性状，则取感病群体DNA，找到其交换单株，通过交换单株不断的缩小区间。
• 4.不断缩小区间的同时，需关注区间内基因的功能，并且结合转录组数据，找到位于BSA区间内，且在双亲中差异表达的基因。
• 5.找到该基因后，即可开始做转基因功能验证了